多克隆位点的作用(什么是多克隆位点)

1. 什么是多克隆位点

PUC 载体是在PBR322 质粒载体的基础上，插入一个在其5‘端带有一段多克隆位点的lacZ'基因，发展成有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

类型有克隆载体、穿梭载体和表达载体，其中克隆载体常用的有pBR322和pUC18 、pUC19，穿梭载体和表达载体就要根据具体实验而定了。

2. 单克隆位点

CRISPR/Cas9系统的原理是利用gRNA特异性识别靶序列，并引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割，从而造成靶位点DNA双链断裂，随之利用细胞的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）的方式对切割位点进行修复，实现DNA水平的敲除、敲入或点突变。

通过核转染法将gRNA、Cas9和Donor共转入细胞中，进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出敲入纯合的阳性克隆。敲入荧光报告基因的也可以通过观察荧光进行初步筛选。

3. 多克隆位点和单克隆位点

4．特异性在比位点IRMA中，一般均应用针对不同位点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的RIA。

5．标准曲线的工作浓度通常RIA的工作范围为2～3个数量级，而RIMA可达3个数量级以上。

6．分析误差RIA中加入的抗体和标记抗原都是定量的，加样误差可严重影响测定结果。IRMA中标记和固相抗体在反应中都是过量的，只有受检标本的加样误差才会影响分析结果。因此，IRMA的批内和批间变异均比较小。

7．其他RIA可以测定大分子量与小分子量的物质，双位点IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。

在RIA中应用的多为克隆抗体，亲和力和特异性要求较高，但用量很少。IRMA中标记抗体和固相抗体用量较多，一般均用来源丰富、特异性较高的单克隆抗体。

4. 多克隆位点和酶切位点

基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，而基因表达载体的本质是DNA，组成元素有碳氢氧氮磷，其中氮在含氮碱基中，磷在磷酸基团中完整的表达载体必须包括：

1、复制子,在细菌中扩增时所必须.

2、启动子,目的基因在细菌或细胞中转录所必须,转录了才能翻译,是谓“表达”.

3、原核筛选标记,细菌增菌所必须.

4、真核筛选标记,如果是真核表达,就是必须的.

5、多克隆位点,即酶切位点,插入目的片段的区域.

6、其他所需构件,可视实验设计情况而选用现成载体或在载体上自行添加.另：表达的起始和终止,在目的基因上附带起始密码子和终止密码子.

5. 什么是质粒的多克隆位点

pMD®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。本载体与pMD®18-T Vector 相比，本制品的 β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。

简而言之，就是一种可以将taq酶（注意：pfu不具备在产物两端加“A”碱基的能力）扩增的两端带有A碱基的产物连入这种载体，从而通过大肠杆菌扩增的载体，而且可以通过蓝白筛选来筛选阳性克隆，插入成功的为白，不成功为蓝。图谱可以去takara上下说明书。

6. 多克隆位点是什么意思

每个载体都有一个多克隆位点.我们的目的片段一般都会插进这个位置.当我们利用pcr检验多克隆位点插入的片段时,既可以用该片段的引物pcr扩增检验大小,也可以利用该载体多克隆位点的引物pcr扩增检测大小.这就是载体引物,此类引物只因载体的不同而不同,与目的片段无关.而且一般情况下载体引物较为通用,成熟,使用也方便.

7. 什么是多克隆位点?在重组时对其有何要求?

单一酶切位点就是只有一种特定的酶能够识别并进行酶切的位点，多克隆位点一般是位于质粒上的一段序列，这段序列含有很多个酶切位点，但这些酶切位点每一个都被一种酶识别并酶切。

8. 什么是多克隆位点mcs

UC 质粒载体：PUC 载体是在PBR322 质粒载体的基础上，插入一个在其5‘端带有一段多克隆位点的lacZ'基因，发展成有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

常用的为高拷贝质粒(120~ 200个/ 细胞)，含有多克隆位点，以满足多种内切酶切割的DNA段的克隆、PUC 质粒载体的结构类型包括以下四个组成部分：

(1)pBR322质粒的复制起点(ori);

(2)氨苄青霉素抗性基因(amp),但该核苷酸序列经过改造，没有原限制性核酸内切酶的单识别位点;

(3)大肠杆菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码a-肽链的DNA序列(即lacZ'基因);

(4)位于IacZ'基因中的靠近5'端引人了一段多克隆位点(MCS)区段，但它不会引起编码肽链功能的改变。

9. 什么叫多克隆位点

MCS在生物学的意义是多克隆位点（multiple cloning site ，MCS）。

中文名：多克隆位点

外文名：MCS

MCS在生物学的意义是多克隆位点（multiple cloning site ，MCS），是包含多个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列，也称为多位点接头（polylinker），是外源基因插入的位置。MCS是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。常见的基因工程载体都具有多克隆位点，有些载体如λEMBL4、Charon40等甚至有两个多克隆位点。

10. 关于多克隆位点的描述,不正确的是

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。

　　质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松弛控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。（5）对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。