pcr中dNTP作用(pcr为什么用dntp)

1. pcr为什么用dntp

PCR反应需要加镁离子，并且镁离子浓度的总量应该比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L。 镁离子是加在PCR反应的缓冲液中的，成分是最复杂的，除水外一般包括四个有效成分：

1、缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；

2、一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；

3、二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；

4、辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。 缓冲液的目的是提供合适的酸碱度与某些离子，而PCR反应五要素是：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

2. PCR为什么用内参

内参一般是RT-PCR用的，当底物是cDNA文库这种混合物时，除了扩增目的片段，往往还要扩增一个内参。内参一般选择细胞内的管家基因，表达量不会随着细胞状态而变化的，如U6，GAPDH等。由于PCR定量结果受底物影响较大，枪不准或者操作不当带来的很大误差，所以用目的片段的定量结果除以内参的定量结果，就能得到一个相对准确的比值，即相对定量。

内标一般是用在普通pcr之后的跑电泳过程中。marker是一系列确定大小的DNA片段，跑出一个ladder，然后你的扩增片段与ladder比较，就可以知道片段的大概长度，然后判断是不是你要的片段，还是杂带。

3. PCR为什么用脱氧核苷三磷酸

逆转录PCR或者称反转录PCR，是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

其作用：

1、DNA聚合酶活性，以RNA为模板，催化脱氧核糖核苷三磷酸聚合成DNA的过程。

2、DNA指导的DNA聚合酶活性，以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以脱氧核糖核苷三磷酸为底物，再合成第二条DNA分子

3、具有酶催化消化信使RNA的能力。

4、逆转录酶：又称为依赖RNA的DNA聚合酶。

4. PCR为什么用dNTP

PCR反应中缓冲液是一个重要的影响因素，特别是其中的Mg2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率。目前最为常用的缓冲体系为l0～50mmol／L的Tris—HCl(pH8．2～8．3，20℃)，PCR标准缓冲液含有10mmol／L的Tris—HCl(pH8．3)、50mmol／L的KCl、1．5mmol／L的Mg2+、0.1g／L的明胶。在一般的PCR反应中，1．5～2．0μmol／L Mg2+是比较合适的(对应dNTP浓度为200μmol／L左右)。Mg2+过量能增加非特异扩增并影响产率。

现在认为限制KCl和明胶的用量值得提倡，尤其是BSA，虽其对酶有一定保护性，如果质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。KCl在50mmol／L时能促进引物退火，大于此浓度时将会抑制聚合酶的活性。有的反应液以氯化铵或醋酸铵中的NH+才代替K+，其浓度为16．6mmol／L。

在PCR中使用10～50mmol／L Tris HCl，主要靠其调节pH使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。Tris缓冲液是一种双极化离子缓冲液，pKa为8．3(20℃)，△pKa为一0.021／℃。

在反应体系中加入适量(10％)的二甲基亚砜(DMSO)，虽然DMSO对聚合酶活性有一定抑制作用，但它可减少模板二级结构，提高PCR反应特异性。有报道指出甲酰胺或氯化四甲基铵(TMAC)均可提高反应特异性，而对酶活性没有明显影响。

PCR标准缓冲液对大多数模板DNA及引物都是适用的，但对某一特定模板和引物的组合，标准缓冲液并不一定就是最佳条件，因此各实验室可在此条件上，根据具体扩增项目进行改进。其中Mg2+浓度对扩增作用的特异性和产量有明显影响。Taq酶是一种Mg2+依赖酶，Mg2+浓度一般为1．5mmol／L左右，Mg2+浓度过低时，酶活力明显降低；过高时，酶可催化非特异性扩增。由于反应体系中的DNA模板、引物和dNTP都可能与Mg2+结合，因此降低了Mg2+的实际浓度。所以建议反应中Mg2+用量至少要比dNTP浓度高O．5～1．0mmol／L。

5. pcr为什么用dna作引物

你做的是不是RT-PCR， 这个就是以反转录得到的cDNA为模板的。

我们做的时候一般是提取植物总的RNA，然后采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，主要是获得目的基因或检测基因表达，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。因为直接提取DNA的话，并不能证明该基因在其他细胞体内进行表达，通过这种方法可以克服假阳性。仅供参考。

6. PCR为什么用两种引物

因为第一轮循环以加入的基因组等为模板，上下游引物分别结合反义链和正义链，扩增获得长度不等的pcr产物，然后第二轮以第一轮的产物为模板，扩增获得较短（与第一轮的产物比较）且长度不等的pcr产物，此时的pcr产物只受到上游或下游单条引物的限制，所以长度不等，第三轮扩增以第二轮的产物为模板，同时受到上下游引物的限制，获得两条引物间的序列。

7. pcr为什么用dntp不用ntp

双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术（也即第一代DNA测序技术），由Sanger等1977年发明提出。主要用于DNA基因分析。其原理是：

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。

如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。

1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP（包括放射性标记的ddNTP，例如32P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。

3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。

5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。